Ensaio clínico de Fase I/II com Células Natural Killer (NK) expandidas ex vivo para o tratamento de Leucemia Mielóide Aguda (LMA)

Padronizar o isolamento e a expansão de células NK ex vivo de células NK provenientes
de sangue de cordão umbilical, expandidas com IL-21 que serão infundidas em pacientes com
LMA refratários e recidivados, LMA e SMD de alto risco após quimioterapia de reindução e
linfodepletiva com fludarabina, citarabina e G-CSF (FLAG) visando avaliar a dose máxima
tolerada, segurança, eficácia para tratamento e potencial cura dos pacientes. Caracterizar
essas células de acordo com a funcionalidade e citotoxicidade

Determinar a dose máxima tolerada, segurança, e viabilidade da infusão das células NK
proveniente de sangue de cordão umbilical expandidas junto a quimioterapia de
indução linfo-depletiva em pacientes com LMA refratária e recidivada, LMA e SMD de
alto risco, com redução de custos ao SUS visando o melhora tratamento e potencial
cura para as patologias citadas. A. Determinar a persistência das células NK expandidas transferidas de forma adotiva
B. Determinar a resposta global
C. Correlacionar o fenótipo, persistência e função da célula NK com resposta global. A. Padronizar e validar a expansão de células NK ex vivo;
B. Caracterizar as células NK avaliando a viabilidade celular, imunofenotipagem,
esterilidade (endotoxina) e cariótipo;
C. Caracterizar a funcionalidade (dosagem CD107a) e a citotoxicidade (dosagem de TNFα,
IFNγ, perforinas e granzima B) das células NK contra células alvo tumorais.

A Leucemia Mielóide Aguda (LMA) é uma doença hematológica clonal agressiva, que
apresenta um bloqueio na diferenciação de células progenitoras hematopoiéticas e alteração
da regulação da proliferação celular (Frohling et al. 2005). De acordo com o Instituto Nacional
de Cancer (INCA), para 2018-2019 são estimados 5.940 casos novos de leucemia em homens e
4.861 em mulheres, correspondendo a um risco estimado de 5,75 casos novos para cada 100
mil homens e 4,56 casos novos para cada 100 mil mulheres (INCA, 2018).
A LMA,representa apenas 15-20% das leucemias agudas na infância, faixa etária em
que a leucemia linfoide aguda (LLA) é muito mais prevalente. Com o tratamento, cerca de 60-
80% dos jovens e 20-30% dos pacientes idosos com LMA atingem remissão hematológica.
Entretanto, 10% e 40% dos pacientes não conseguem atingir remissão completa (refratários)
ou são incapazes de manter a completa remissão (recidivados). Neste grupo de pacientes, a
chance de se atingir a taxa de remissão completa com tratamentos futuros é baixa, geralmente
inferior a 10% (Forman; Rowe, 2013; Dohner et al. 2017; Walter et al. 2015; Thol et al. 2015).
Apesar da disponibilidade de muitas técnicas para o diagnóstico diferencial e o
prognóstico da LMA, esta ainda é uma doença fatal na imensa maioria dos casos,
representando um investimento enorme e mal sucedido para o SUS. As taxas de remissão
completa (RC) com a quimioterapia de indução em pacientes idosos com LMA estão na faixa
de apenas 40 a 50% e as taxas de sobrevida, com mediana de 10 anos, são inferiores a 10%
(Vardiman et al. 2009). A sobrevida de pacientes com LMA diminui drasticamente com a idade,
com sobrevida relativa de 5 anos em 65,9% em pacientes com menos de 15 anos de idade,
49,9% em pacientes entre 15 e 39 anos de idade e 16,7% em idosos (Keegan et al,
2016; Siegel et al., 2015, Ho et al. 2017).
Assim, há uma grande necessidade de melhorar o tratamento em pacientes com LMA.
Embora tenha sido feito progresso ao longo das últimas décadas no campo da
imunologia tumoral, ainda precisamos de pesquisas sobre estratégias alternativas baseadas no
sistema imune e que possam mediar a regressão tumoral em modelos pré-clínicos e clínicos.
Atualmente, vários estudos têm demonstrado sucesso no desenvolvimento de novos
protocolos de tratamento com células Natural Killer (NK) para pacientes com LMA não
respondedores (Silla, 2016; Farhan et al. 2012; Lee et al. 2016; Dolstra et al. 2017).
Células NK são linfócitos do sistema imune inato, que tem a capacidade de lisar as
células alvo, além de fornecer citocinas imunorregulatórias. Foram primeiramente
identificadas pela habilidade em matar células tumorais e células infectadas por vírus sem sensibilização prévia. A principal função das células NK maduras é a atividade citotóxica,
ocorrendo pela exocitose de grânulos e indução de apoptose pela sinalização via membros da
família de receptores de morte celular do fator de necrose tumoral (do inglês, Tumoral
Necrosis Factor).
A citotoxicidade mediada por células NK é iniciada pela adesão à célula alvo que induz
alterações em sua morfologia com movimentação dos grânulos líticos em direção ao sitio de
interação com a célula alvo. Os princiapis conteúdos desses grânulos são moléculas de
perforina e granzima. O outro mecanismo de morte celular mediado por células NK é através
da ligação de receptores específicos presentes nas células alvo com ligantes na superfície das
células NK. Esses ligantes pertencem à superfamília do TNF e a sua ligação induz à apoptose da
célula alvo. Atualmente, são conhecidos dois subtipos distintos de células NK através de
diferenças na densidade de expressão de superfície de CD56. A maioria das células NK
humanas tem baixa expressão de CD56 e alta expressão de CD16, e são conhecidas como
células CD56dim. A outra subpopulação é caracterizada por alta expressão de CD56 e
expressão baixa ou negativa de CD16 e por isso é chamada de CD56bright. Essas duas
subpopulações também têm características funcionais distintas: a CD56dim é a mais citotóxica,
enquanto a CD56brigth é a maior responsável pela produção de citocinas imunorregulatórias,
incluindo TNF alta.(α) e beta (β), interferon gama (IFN-γ), fator estimulador de colônia de
granulócitos e macrófago (GM-CSF), interleucina (IL) 10 e 13.
Tendo em vista todo o potencial citotóxico das células NK, as possíveis implicações
terapêuticas destas células são cada vez mais reconhecidas. Testes clínicos evidenciam que as
células NK desempenham um papel no desfecho de pacientes submetidos ao transplante de
células-tronco hematopoiéticas e a transferência adotiva de células NK haploidênticas
humanas ativadas apresenta um papel potencial no tratamento da LMA (Shaffer et al. 2016;
Lee et al. 2016; Boyiadzis et al. 2017). As células NK fornecem uma alternativa atrativa para o
tratamento de neoplasias como LMA e estudos mostram que o sangue cordão umbilical é uma
fonte promissora para obtenção de células NK alogênicas que podem ser expandidas em
grande quantidade em doses altamente funcionais para a terapia em pacientes com LMA
refratários, além da possibilidade de se utilizar um produto rapidamente disponível
considerando a grande quantidade em bancos públicos no Brasil e no mundo (Kerbauy et al.
2017; Liu et al. 2017; Rezvani et al. 2017; Dolstra et al. 2017).
Neste contexto, nosso grupo visa padronizar o isolamento e expansão de células NK ex
vivo a partir de sangue de cordão umbilical, caracterizar essas células de acordo com a
funcionalidade e citotoxicidade e realizar um estudo de Fase I/II para determinar a segurança, eficácia, viabilidade e dose máxima tolerada em pacientes com LMA refratária e recidivada e
Síndrome Mielodisplásica (SMD) de alto risco.
A proposta ora em submissão visa o desenvolvimento de nova tecnologia para o
tratamento do câncer – no caso a LMA, que objetiva a médio/longo prazo o estabelecimento
de terapêutica inovadora para auxiliar o Transplante de células-tronco hematopoiéticas (TCTH)

– procedimento de altíssima complexidade, sabidamente acompanhado de significativa morbi-
mortalidade, considerando 5% - 15% de taxa de sobrevida relativa em 5 anos (Alatrash et al.

2011). Nosso sistema público, não apenas financia os TCTH como também o tratamento para o
resto da vida de suas complicações. Atualmente, de acordo com a tabela SUS, o custo médio
de um TCTH não aparentado por paciente é em torno de R$ 120.000,00, não contabilizando
gastos com medicações de manutenção e eventual recidiva da doença. A expectativa é que,
com esta modalidade terapêutica, possamos minimizar os custos do SUS com o tratamento
bem sucedidos dos pacientes com LMA refratária ou SMD de alto risco.
A tecnologia para a Terapia Celular Adotiva (anti-cancer) propiciará aos pesquisadores
brasileiros a possibilidade de investigar esta modalidade terapêutica em inúmeros casos de
LMA. A médio/longo prazo, o desenvolvimento de terapias alternativas para o tratamento dos
pacientes com LMA representará um avanço, não apenas para o SUS, mas para a comunidade
científica e médica mundial, beneficiando e, possivelmente, curando a leucemia aguda mais
frequente no adulto, no Brasil e no mundo.

O projeto demonstra forte evolução técnica, com avanços na padronização, expansão, caracterização e testes de funcionalidade das células NK, tanto in vitro, quanto in vivo, além do desenvolvimento do Produto de Terapia Avançada (PTA) exigido pela ANVISA. O relatório técnico-científico descreve que a execução avançou com sucesso em:

Padronização do isolamento e expansão ex vivo das células NK

Caracterização fenotípica e funcional (imunofenotipagem, citotoxicidade, esterilidade, cariótipo)

Ensaios pré-clínicos obrigatórios para aprovação como PTA

Estudos com animais para validação de segurança, migração e persistência celular

Preparação para o estudo clínico Fase I/II

Essas entregas atendem às exigências regulatórias pós-2018 e representam evolução significativa do projeto.