Projeto Genomas Raros: aplicação da genômica para o diagnóstico de doenças raras e do risco hereditário de câncer no Brasil, em serviços públicos de saúde. Projeto Genomas Raros

As doenças raras, em conjunto, abrangem um grupo de 9603 enfermidades distintas, e têm uma prevalência cumulativa estimada em 1,5 a 6,2% da população (FERREIRA, 2019). Isso representa, no Brasil, um número total de 3,2 a 13,2 milhões de indivíduos, com grande impacto nos serviços de saúde. Especialmente desafiadora é a realização do diagnóstico definitivo desses pacientes, levando a verdadeiras peregrinações dentro do sistema de saúde, com grande atraso e consequente aumento de morbidade e mortalidade (STARK et al., 2019). Segundo os dados disponíveis no banco de dados OMIM, cerca de 5590 fenótipos apresentam uma base molecular conhecida, necessitando de teste específico para sua identificação, que, em geral, não está disponível no sistema único de saúde (SUS). Este projeto visa avaliar geneticamente pacientes com doenças raras no âmbito do SUS, através do uso do sequenciamento completo do genoma, e disponibilizar os dados em um banco nacional de dados genéticos, de uso público.

Com o implemento da tecnologia de Sequenciamento de Nova Geração (NGS, da sigla em inglês para Next Generation Sequencing) houve um avanço exponencial na velocidade com que se pode sequenciar o genoma humano e uma redução de mais de 10.000 vezes nos custos de sequenciamento (LAPPALAINEN et al., 2019). Essa evolução tecnológica viabilizou o uso do sequenciamento completo do genoma (chamado Whole Genome Sequencing – WGS) em larga escala, tornando possível a identificação das bases moleculares de doenças genéticas raras, e da determinação de um número crescente de genes associados a doenças de origem genética. No que se refere ao diagnóstico do câncer hereditário, o WGS apresenta uma nova alternativa ao diagnóstico molecular, possibilitando identificar variantes com potencial risco de desenvolver os diferentes tipos de câncer, quando comparado à população geral, o que permite uma medicina preventiva de precisão.

A aplicação dessa metodologia em larga escala, no contexto do estudo de doenças raras, com o diagnóstico mais preciso, propiciando uma racionalização dos custos de investigação, abre também espaço para a aplicação da ferramenta genômica em outros campos da investigação biomédica associada ao câncer. O genoma completo também é potencialmente capaz de substituir o uso de outros exames, levando não só à diminuição do custo total com a investigação genética, mas também a uma diminuição do tempo total da jornada diagnóstica (LIONEL et al., 2017). Além disso, o conhecimento do diagnóstico exato pode permitir uma terapia adequada, com melhores desfechos no longo prazo.

Diversos países criaram programas de alcance nacional para o estudo genético de sua população, com o objetivo comum de mapear a diversidade de suas populações para que no futuro pudesse ser aplicada uma medicina de precisão baseada em genética (MANOLIO et al., 2015). A Inglaterra, que tem um serviço de saúde integralmente público, terminou recentemente seu projeto de sequenciamento de 100 mil genomas de indivíduos com doenças raras e hereditárias, e pacientes com câncer. O objetivo do projeto consistiu em montar a infraestrutura necessária para implementação da genômica na prática clínica no sistema público de saúde, prover diagnósticos dessas doenças e avaliar o impacto dos achados nos custos de diagnóstico e tratamento das diversas condições. A conclusão do projeto levou à implementação definitiva da medicina genômica no sistema público de saúde inglês como uma ferramenta (BARWELL et al., 2018). Austrália, Bélgica e Canadá vêm conduzindo projetos similares de abrangência populacional com objetivos de identificar doenças genéticas, criando um banco de dados de alterações genéticas de suas populações, e treinando a próxima geração de clínicos e pesquisadores que irá lidar com esse tipo de tecnologia e precisa de treinamento específico. Outros países com projetos de âmbito nacional em genômica incluem França, Israel, Estônia, Índia, Japão, Coréia, Luxemburgo, Singapura, Sri Lanka, Tailândia e Luxemburgo (STARK et al., 2019a).

O Brasil, por se tratar de uma população com uma história bastante peculiar, não encontra sua população representada em estudos de outros países ou iniciativas internacionais, sendo fundamental um estudo que envolva o país como um todo, incluindo suas particularidades regionais (LEK et al., 2016). O maior projeto de sequenciamento genético brasileiro hoje consiste no projeto ABraOM (NASLAVSKY et al., 2017), que envolve cerca de 1300 indivíduos de 60 anos sem morbidades autodeclaradas do estado de São Paulo. É possível observar que o projeto se limita a uma única região do país e não abrange indivíduos doentes. No Brasil, atualmente, não há nenhum projeto de abrangência nacional envolvendo sequenciamento de genomas de pacientes. Todos os estudos realizados até o momento são de pequena escala e pontuais, com sequenciamento de genes específicos em diferentes áreas da medicina.

O sequenciamento desses pacientes proverá diagnósticos de alta qualidade, com impacto direto na saúde pública e no sistema público de saúde, além de possibilitar a criação do maior banco de dados genéticos da população brasileira, com grande quantidade de dados de variações genéticas raras. Projetos de grande escala como esse são fundamentais para a implantação da aplicação de medicina de precisão e genômica personalizada nos serviços pelo SUS.

Após a análise do sequenciamento, as análises incluirão a integração com os dados clínicos definitivos, permitindo a correlação entre genótipo e fenótipo e possibilitando a criação de ferramentas de suporte à decisão clínica, com impacto direto na prática médica, e consultas com os geneticistas. O projeto disponibilizar um médico geneticista que fará a interpretação do resultado e servirá de apoio aos profissionais designados pela instituição parceira para acompanhamento dos casos.

Para o próximo triênio, será solicitada continuação do projeto com o sequenciamento e alimentação do banco de dados com mais 15 mil amostras, e a organização de um sistema de teleconsultoria para o aconselhamento genético e treinamento dos profissionais do SUS, além da extensão da pesquisa em familiares que podem se beneficiar do aconselhamento. Também será contemplado para o próximo triênio publicações científicas com os dados coletados.

Metodologias a serem utilizadas

Inclusão de centros e pacientes

Os centros participantes receberão informação do estudo através de um convite para participação. Para que eles possam participar do estudo clínico, os investigadores têm de confirmar que: (1) receberam e leram o protocolo e concordam com a participação no estudo; (2) irão seguir o protocolo de acordo com os critérios de inclusão e exclusão dos pacientes; (3) o estudo tem aprovação do comitê de ética da instituição (caso presente); (4) que todos os pacientes participantes do estudo receberão e assinarão o termo de livre consentimento informado e uma cópia será guardada; (5) concordam em fornecer as informações necessárias através de sistema de coleta de dados na internet conforme definição prévia do protocolo; (6) que o material necessário para pesquisa será enviado conforme indicado.

Quando o centro for totalmente registrado, poderá haver recrutamento de pacientes. Pacientes devem ser consentidos para participação no estudo usando o Termo de Consentimento Livre e Informado, para os indivíduos menores de idade ou incapazes, o responsável assinará o Termo de Assentimento.

Os pacientes recrutados deverão ter seus dados de diagnósticos preenchidos em formulário eletrônico até 15 dias após inclusão. Caso os formulários não sejam preenchidos haverá o contato dos monitores de pesquisa clínica para complementação dos dados, ou possível visita presencial, pois os indivíduos seguirão para o sequenciamento somente uma vez que todas as informações clínicas estejam disponíveis.

O recrutamento será semi-aberto. Os pacientes serão indicados pelos investigadores nos centros que preencham os critérios de inclusão. Estimamos o início de recrutamento para Janeiro de 2020. Estimamos receber amostras de aproximadamente 700 pacientes mensalmente até Dezembro de 2020. Toda a logística para envio de material de coleta e retirada do material será realizada pelo projeto. Por se tratar de uma população já mapeada pelos centros, com um representativo histórico clínico e necessidade de exames genéticos, esta demanda é considerada factível para o território nacional. Porém, o início da coleta depende diretamente do tempo de aprovação dos Comitês de Ética locais, o que pode diminuir a quantidade de indivíduos aptos a participar do estudo. Na primeira visita do paciente será feita a explicação dos termos do projeto, assinados os Termos de Consentimento e coletadas as amostras. Não há necessidade de retorno ao centro após a coleta.

Devido a desvios imponderáveis de cronograma, foi considerado um cenário de sequenciamento maleável contemplando entre 5 e 7 mil amostras de pacientes abrangendo os dois desenhos geneticamente definidos, e o número final de indivíduos dependerá da data de inclusão dos centros e da viabilidade e validação dos equipamentos nos dois períodos. Conforme mencionado na justificativa do projeto, as amostras serão sequenciadas em novo pedido de projeto PROADI, para o próximo triênio (2021-2023).

Critérios de inclusão e exclusão para doenças raras:

Inclusão
1. Ambos os sexos;
2. Todas as faixas etárias;

3. Aceite e assinatura dos Termos de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) e de Assentimento, pelo paciente ou responsáveis;

4. Doenças raras sem diagnóstico molecular, que incluem doenças genéticas conhecidas (como exemplo as doenças descritas no banco de dados OMIM - https://omim.org/
), ou probando com uma ou mais malformações ou prejuízos funcionais em sistemas, de provável causa genética, ou afecção com história familiar compatível com modelos de herança mendelianos;

5. Paciente pediátrico com alterações sugestivas de transtorno metabólico, epilepsia, prejuízo de função neurofisiológica, ou com internamento em UTI sem diagnóstico de causa adquirida;

6. Doenças cujo mecanismo fisiopatológico primário não seja investigado pelo método de sequenciamento de nova geração, como alterações epigenéticas e expansão de trinucleotídeos, serão incluídos apenas após realização de exame específico com resultado negativo;

7. Diagnóstico de tumores sólidos, identificados em um probando com menos de 50 anos, com ou sem familiares afetados.

Exclusão:

1. Ausência de consentimento válido ou falta de vontade de dar consentimento ou participação em todos os aspectos do Projeto (isso exclui opções de recusa para feedback aos participantes);

2. Identificação prévia de diagnóstico molecular, compatível com quadro clínico, no probando ou em um membro da família afetado com a mesma condição;

3. Identificação de causas adquiridas subjacentes primárias como infecções, injúrias peri-natais, autoimunidade adquirida, trauma, processos inflamatórios, degeneração decorrente da idade, uso de substâncias externas, prematuridade;

4. Transplante de medula óssea;

5. Nenhuma evidência de um fenótipo herdado ou de doença rara;

6. Fenotipagem inadequada ou falha em fornecer dados e amostras ao Biorepositório Central;

7. Não aceite e assinatura do Termo de Recoleta pelo paciente ou responsáveis.

Amostras

Sangue Periférico: Serão coletadas amostras em tubos de coleta específicos para cada teste molecular;

Tubo com EDTA - Sequenciamento genômico (0-3 anos mínimo de 1-3ml, acima de 3 anos mínimo de 3 ml)

Tubo estável para RNA - Biorepositório (0-3 anos mínimo de 1ml, acima de 3 anos mínimo de 2,5 ml)

Saliva: Somente será coletada em circunstâncias raras, como por exemplo pela ausência do colaborador responsável pela coleta de amostra sanguínea, sendo assim, será coletada pelo médico responsável.

DNA Extraído: Serão aceitas amostras de DNA extraído apenas em circunstâncias excepcionais e se atingirem os parâmetros mínimos de qualidade para realização do sequenciamento, determinado durante o processo de validação da técnica.

A coleta das amostras ocorrerá em tempo real e especificamente para o projeto em questão. As coletas ocorrerão de acordo com os Procedimentos Operacionais de cada Instituição participante, sendo manipuladas por colaboradores designados e aptos para tal, e com treinamentos regulares para a competência.

Diretrizes institucionais de segurança serão aplicadas para o manuseio de materiais biológicos humanos, bem como para produtos químicos perigosos.

Identificação da amostra

Um número identificador único será atribuído para cada paciente no momento da aplicação e aceitação do TCLE. Junto a este número identificador será fornecido um outro número pelo Sistema Único de Saúde (SUS) e ambos serão utilizados todas as identificações futuras. Estas identificações deverão ser seguidas rigorosamente em cada etapa. Em caso de coleta de amostras com erros de codificação, estas serão descartadas, e o material colhido seguirá o fluxo até a extração de DNA.

Entregas e Atividades Correlacionadas

Compra das máquinas e insumos;

Aprovação do CEP do HIAE;

Estabelecimento dos centros de pesquisa parceiros e aprovação nos CEPs respectivos;

Formulação do questionário de inclusão e determinação dos critérios de inclusão e exclusão no estudo;

Inclusão: diagnóstico de doença rara, dentro das doenças estabelecidas.

Exclusão: diagnóstico genético direto ou já realizado

Inclusão: Assinatura do termo de consentimento

Inclusão: Acesso aos dados clínicos completos

Coleta das amostras, sangue ou saliva conforme disponibilidade. Logística de envio e recebimento dos kits nos dois centros;

Extração de DNA;

Preparo das bibliotecas para sequenciamento completo de genoma;

Sequenciamento completo do genoma;

Processamento das informações (alinhamento, chamada de variantes (SNV, CNV e estruturais));

Armazenamento dos dados brutos do sequenciamento;

Anotação das variantes encontradas regiões codificantes e não-codificantes;

Disponibilização dos dados de variantes anotadas para os centros de pesquisa;

Treinamento dos profissionais para análise dos resultados de genoma;

Análise das variantes caso a caso por médico geneticista treinado;

Retorno ao centro de pesquisa sobre os resultados relevantes encontrados;

Construção do banco de dados de armazenamento e consulta dos dados de todos os indivíduos pertencentes ao estudo.

Cronograma das Entregas / Atividades / Marcos – 2020

Entrega 1 – Montagem da infraestrutura do projeto / Treinamento / Publicidade

Atividade 1.1: Formação das listas de patologias incluídas no projeto

Execução: 1º semestre (F)

Atividade 1.2: Definição dos diversos centros que participarão do projeto em conjunto com o Ministério da Saúde

Execução: 1º semestre (C)

Atividade 1.3: Envio do projeto aos Comitês de Ética

Execução: 1º semestre (C)

Atividade 1.4: Treinamento dos centros nos procedimentos de recrutamento

Execução: 1º semestre (C)

Atividade 1.5: Instalação e validação dos equipamentos de sequenciamento - NovaSeq 6000

Execução: 1º semestre (C)

Atividade 1.6: Protocolos Operacionais Padrão desde a coleta do dado

Execução: 1º semestre (F)

Atividade 1.7: Montagem da infraestrutura de TI e bioinformata/teste com os fornecedores de cloud

Execução: 1º semestre (F)

Atividade 1.8: Montagem do site para coleta de informações e documentos do projeto e entrega dos relatórios com os resultados de cada caso

Execução: 1º semestre (F)

Entrega 2 – Sequenciamento das amostras

Atividade 2.1: Transporte de amostras

Execução: 2º semestre (F)

Atividade 2.2: Sequenciamento de 850 amostras

Execução: 2º semestre (C)

Atividade 2.3: Devolutiva dos resultados aos pacientes

Execução: 2º semestre (A)

Entrega 3 – Disponibilização Pública dos dados

Atividade 3.1: Entrega dos Dados de Variações Clínicas

Execução: 2º semestre (A)

Legenda
“C” se houve execução da atividade conforme prazo planejado ou encontra-se adiantada
“A” se houve execução da atividade e a mesma encontra-se atrasada
"F" se a atividade foi finalizada. Deixar em branco caso a atividade não tenha sido iniciada

Notebook
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