Desenvolvimento de células CAR-T para tratamento de neoplasias B malignas

· Desenvolver produto de terapia celular avançada, com efeito, antitumoral contra células CD19-positivas;

· Qualificar e validar a tecnologia de manipulação genética de células T no sistema
fechado ProdigyR (Mylteni – Alemanha);

· Desenvolver testes de qualidade das células CAR-T anti-CD19 produzidas;

· Desenvolver a criopreservação das células CAR-T para que possam ser
utilizadas no futuro, em outros centros do país;

· Tratar pacientes com neoplasias B malignas, refratários ao tratamento
convencional;

Entre os pacientes com neoplasias recidivadas e refratárias, a terapia celular é uma nova
imunoterapia que se mostrou promissora em estudos pré-clínicos e clínicos iniciais. Esta
terapia permite que os linfócitos T de um paciente sejam geneticamente modificados para
reconhecer antígenos associados a tumores (por exemplo, CD19). Os linfócitos T têm tanto
funções efetoras, quanto de memória, no sistema imunológico. Ao modificar células T
nativas com um receptor de antígeno quimérico (do inglês Chimeric Antigen Receptor,
CAR), essas células podem ser direcionadas contra qualquer antígeno extracelular (1).
Atualmente, as células CAR-T mais bem estudadas e clinicamente validadas reconhecem o
CD19, uma molécula da superfície celular em células B e malignidades de células B. Uma
série de ensaios clínicos usando células quiméricas – CAR-T (Chimeric Antigen Receptor – T
cells) anti-CD19 em leucemia linfoide aguda demonstraram respostas sustentadas em
pacientes com doença avançada (2–5) criando uma alternativa de tratamento para o
câncer. Os tratamentos com CAR-T anti-CD19 para leucemia linfoblástica aguda (LLA)
refratária e para Linfoma difuso de grandes células B foram aprovados pelo FDA em 2017
e 2018, respectivamente.
Apesar de evidências de eficácia da terapia celular CAR-T contra algumas neoplasias
malignas, a manufatura desse produto de terapia celular é complexa, exige profissionais
com expertise avançada bem como infraestrutura que atenda os preceitos de Boas Práticas
de Fabricação para manipulação extensiva de células, sendo em grande parte realizada de
forma centralizada. Como resultado, produtos de células CAR-T disponíveis atualmente no
mercado como tratamento aprovado possuem custo muito elevado, o que limita o seu
acesso à população de forma geral, particularmente em países em desenvolvimento (6,7).
Assim, apesar dos avanços terapêuticos com o uso de CAR T em estudos clínicos (8), ainda
não se tem o desenvolvimento de nenhum estudo clínico com esta nova modalidade de

tratamento no Brasil, além de poucos centros empenhados na elaboração de estudos pré-
clínicos e exploração desta tecnologia.

O presente projeto irá desenvolver uma tecnologia para a produção nacional de células
CAR-T em sistema fechado, em pontos críticos do processo de manufatura, avaliando a
qualidade do produto final, seu custo final estimado e viabilidade para uso em estudo
clínico futuro. O protocolo para o estudo clínico em si será objeto de nova proposta a ser
encaminhada como etapa 2 do projeto, para apreciação no próximo triênio do PROADI.

Partes interessadas
Técnicos e gestores de Agências Regulatórias e de Centros de Terapia celular, profissionais
da saúde e pacientes. Estamos desenvolvendo um projeto visando à incorporação de uma
nova tecnologia para o tratamento de neoplasias B refratárias. Com essa plataforma de
modificação genética de células T, poderemos incentivar e treinar outros centros nacionais
no desenvolvimento desta tecnologia. E futuramente, está tecnologia poderá ser
incorporada para o tratamento de outras doenças malignas hematológicas como, por exemplo, leucemia mielóide aguda e mieloma múltiplo, assim como tumores sólidos. A
médio/longo prazo, o desenvolvimento dessa tecnologia no país viabilizará sua aplicação
clínica, propiciando o tratamento de pacientes com neoplasias.

Contribuições esperadas para o SUS
As leucemias são o tipo mais frequente de câncer em pacientes pediátricos. Cerca de
11.000 novos casos são diagnosticados a cada ano no Brasil. Estima-se que a Leucemia
Linfoide Aguda ocorra em 1/100.000 adultos e crianças/ano. Cerca de 20% das crianças
serão refratárias ou apresentarão recidivas e 30 a 50% dos adultos não apresentarão
resposta ao tratamento inicial, necessitando de transplantes de medula óssea. Estimamos
assim, uma população de no mínimo 300 pacientes/ano que necessitarão de terapia T Car.,
somente para esta doença. Sabe-se que atualmente a tecnologia CAR é extremamente cara.
Os produtos disponíveis das empresas Novartis e Gillead custam em $375000 e $475000
(dólares) sem contar a internação, quimioterapia e atendimento a possíveis eventos
adversos. Neste cenário, o uso de produtos comerciais inviabilizaria o sistema.
Entendemos, portanto, que o investimento nesta área de atuação e domínio dessa
tecnologia permitirá que, no longo prazo, iniciativas nacionais possam desenvolver
produtos de terapia celular avançadas com menor custo e maior acessibilidade aos
pacientes. Deste modo, urge que tenhamos alternativas em nossos laboratórios de
processamento celular, hospitais e universidades para uso desta tecnologia. Portanto,
investir em pesquisa nesta área é de importância fundamental no âmbito da saúde pública.

Metodologias a serem utilizadas
Nesta Etapa 1, será desenvolvida a tecnologia de manipulação de células T em sistema
fechado, com a validação da metodologia para produção de células CAR-T. No total, serão
validadas a fabricação de três produtos de terapia celular avançada do tipo células CAR-T
para reconhecimento do antígeno CD19.
Amostras
As amostras serão obtidas de doadores de sangue, após consentimento prévio, para
utilização do Bowl do equipamento de aférese utilizado na doação de plaquetas. Este
conteúdo do Bowl é descartado após a doação e seu resíduo será utilizado para a seleção e
expansão de linfócitos T.
Processamento das células
As amostras extraídas do Bowl serão diluídas em soro fisiológico com albumina 5% até
atingir um volume de 150 ml. Esta amostra será mantida em bolsas para a conexão com o
kit do equipamento Prodigy®.

Avaliação de perfil imunofenotípico
Produtos iniciais, produtos pós-enriquecimento CD4 / CD8, e as células CAR-T finais serão
caracterizadas por citometria de fluxo com os seguintes marcadores de ativação e
exaustão: CD3; CD4; CD8a; CD19; CD22; CD45RA; CD 62L, CD35, FoxP3 e CD127.
Tecnicamente, as células serão ressuspendidas na densidade de 1 a 2 x 106 células/ml em
PBS. Adicionaremos o volume dos anticorpos monoclonais, previamente titulados, na
suspensão celular em tubos próprios para citometria, e incubaremos por 20 minutos ao
abrigo da luz. Após a etapa de marcação, as células serão lavadas e ressuspendidas com
phosphate buffered saline (PBS), para aquisição no citômetro de fluxo. Após leitura das
amostras no equipamento NAVIOS (Beckman-Coulter), todos os dados gerados serão
analisados com o uso do software de análise Infinicyt (Cytognos) e/ou Kaluza (Beckman
Coulter. FACSDIVA (BD Bioscience).

Avaliação da Viabilidade Celular
Para esta análise utilizaremos o kit LIVE/DEADTM Fixable Violet Dead Cell Stain Kit (Life
Technologies), que se baseia na reação do corante utilizado com grupos amina presentes
nas células, e detecção por citometria de fluxo. Em resumo, quando as células estão com
sua membrana comprometida, o corante reage com grupamentos amina presentes tanto
na superfície celular, quanto no interior da célula, resultando numa coloração fluorescente
intensa. No caso de células viáveis, o corante reagirá apenas com aminas presentes na
superfície, resultando numa coloração fraca.
Para realização do experimento, pelo menos 1x10e6 células serão lavadas e
ressuspendidas com 1ml de PBS, será adicionado 1μl do corante, seguido por incubação
por 30 minutos a temperatura ambiente. Após essa etapa de marcação as células serão
lavadas por duas vezes com PBS contendo 1% albumina sérica bovina, ressuspendidas em
1ml deste mesmo tampão, e serão analisadas em citômetro de fluxo NAVIOS (Beckman
Coulter), utilizando-se os canais apropriados para esta fluorescência.
Células não modificadas com o CAR serão utilizadas como controle desses experimentos.
Criopreservação
As células processadas na etapa 1 serão criopreservadas em meio de criopreservação com
10% dimetil sulfóxido, com uma concentração final de 10% de albumina sérica humana.

Estudo de estabilidade
O produto final será avaliado quanto a sua atividade funcional (viabilidade, atividade
citolítica e produção de citocinas) a fresco, isto é, imediatamente após a sua produção, bem
como após sua criopreservação. A estabilidade do produto será avaliada após 30 dias do
congelamento das células CAR T e os dados dos testes funcionais serão comparados aos
dados obtidos antes do congelamento.

Etapa 2:
Esta etapa do projeto consiste em estudo clínico piloto para avaliação de segurança
ao tratamento. Embora o tratamento com células CAR-T dirigidas para CD19 tenha sido
aprovado pelo FDA nos EUA como uma imunoterapia de células T autólogas
geneticamente modificada para pacientes até 25 anos de idade com leucemia linfoblástica
aguda (LLA) refratária ou a partir de segunda recidiva, este é um procedimento inovador e
de alta complexidade.
Como o presente projeto contempla desenvolvimento de método de produção
nacional, com reagentes e metodologias próprias, é necessário inicialmente testar a
segurança e tolerabilidade do produto de terapia celular aqui manufaturado e possíveis
efeitos adversos decorrentes, comparativamente aos métodos aprovados no exterior. No
estudo clínico serão recrutados pacientes com neoplasias B malignas mais frequentes no
país, incluindo-se leucemia linfocitica crônica – CLL refratária ou recidivada, leucemia
linfoide aguda – LLA B refratária ou recidivada, linfoma do tipo não-Hodgkin refratário ou
recidivado.
É valido salientar que, dentro do possível, iremos uniformizar ao máximo as
indicações. As neoplasias B que expressam CD19 são classicamente LLA, linfomas B, LLC e mieloma múltiplo. Os resultados apresentados pelo tratamento da LLA, principalmente em
crianças, mostraram mais de 85% de resposta (Maude SL et al. N Engl J Med. 2018 Feb
1;378(5):439-448). Também, nos linfomas B a taxa de resposta foi de 50-60-% (Schuster
SJ et al. N Engl J Med. 2017 Dec 28;377(26):2545-2554). A LLC foi a primeira doença em
que o CART CD19 foi eficaz (D. Porter et al. N Engl J Med, 365 (2011), 725-733); no
entanto, parece que as respostas não são sustentáveis. Por este motivo, há tendência de
uso conjunto com outros medicamentos como Ibrutinib e Venetoclax (Geyer MB et al. JCI
Insight. 2019 Apr 2;5).

Desta forma as neoplasias B malignas que serão incluídas no estudo serão:
1. Leucemia linfóide aguda B refratária ou recidivada
2. Linfoma não-Hodgkin refratário ou recidivado
3. Leucemia linfocítica crônica refratária ou recidivada

Considerando os critérios de inclusão de acordo com a idade e patologia,
pretendemos distribuir os pacientes em 3 coortes distintas:

Coorte 1: pacientes pediátricos com leucemia linfoide aguda ou linfoma não-
Hodgkin agressivo em pacientes pediátricos (2 a 17 anos completos)

Coorte 2: pacientes adultos com leucemia linfoide aguda (acima de 18 anos)
Coorte 3: pacientes adultos com Linfoma não-Hodgkin ou leucemia linfoide crônica
(acima de 18 anos)
1. Pacientes da Coortes 1 e 2 receberão no início 5x105 células CAR T 19 por kg de
peso do paciente (nível 1).
2. Pacientes da Coorte 3 receberão no início 1x106 células CAR T 19 por kg de peso
do paciente (nível 2).
Para o próximo triênio, pretendemos propor um estudo I/II tendo como desfecho
primários a dose máxima tolerada, segurança e taxa de resposta global em 28 dias desta
modalidade terapêutica. O tamanho amostral para esse propósito é de 30 pacientes.
Recrutamento dos pacientes
Tão logo o projeto seja aprovado, o mesmo será amplamente divulgado entre
Centros Transplantadores, Serviços de Hematologia e Centros de Terapia Celular (CTCs).
Os pacientes que preencherem critérios serão tratados em ordem de chegada. De
preferência, os pacientes serão tratados no Hospital Israelita Albert Einstein e depois serão acompanhados em seu centro de origem. Com a conclusão dos estudos, os
protocolos com melhores resultados poderão ser difundidos em outras instituições do
SUS. Os pacientes serão clinicamente avaliados pela equipe médica e os casos discutidos
por reuniões periódicas de junta de especialistas. Os pacientes que apresentarem evolução
clínica compatível com os critérios de elegibilidade do estudo clínico serão selecionados
pela equipe médica, a qual explicará o estudo e aplicará o termo de consentimento livre e
esclarecido (TCLE), caso haja interesse do paciente e/ou de seus responsáveis

Cronograma das Entregas / Atividades / Marcos

Entrega 1 – Submissão Regulatória

Atividade 1.1: Submeter CEP / CONEP / CTNBIO

Execução: 2019 – 1º semestre (F)

Atividade 1.2: Submissão e aprovação ANVISA

Execução: 2019 – 2º semestre (A)

Entrega 2 – Preencher com o nome da entrega

Atividade 2.1: Aquisição de equipamento e tecnologia para desenvolvimento do produto

Execução: 2020 – 2º semestre (P)

Atividade 2.2: Validação de 1 produto processado na Prodigy

Execução: 2020 – 2º semestre (P)

Atividade 2.3: Validação da criopreservação de células CAR T

Execução: 2020 – 1º semestre (P)

Atividade 2.4: Manipulação do produto GMP

Execução: 2020 – 1º semestre (P)

Atividade 2.5: Testes de esterilidade do produto de terapia celular

Execução: 2020 – 1º semestres (P)

Atividade 2.6: Reunião Técnico-Científica

Execução: 2020 – 1º semestres (P)

Legenda
"P" previsto
“C” se houve execução da atividade conforme prazo planejado ou encontra-se adiantada
“A” se houve execução da atividade e a mesma encontra-se atrasada
"F" se a atividade foi finalizada. Deixar em branco caso a atividade não tenha sido iniciada